來源：干細(xì)胞者說

隨著間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）培養(yǎng)技術(shù)的推廣，外泌體作為高科技概念產(chǎn)品迅速風(fēng)靡細(xì)胞治療和藥妝行業(yè)。當(dāng)然，你聽到的這些應(yīng)用只是外泌體應(yīng)用的冰山之一角。

今天我們就來聊一聊外泌體這個(gè)時(shí)髦的名詞。

風(fēng)靡市場(chǎng)的外泌體相關(guān)產(chǎn)品

其實(shí)，說起外泌體也是鼎鼎大名的，可以說也是諾獎(jiǎng)級(jí)的。2013年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予美國(guó)科學(xué)家詹姆斯·羅思曼、蘭迪·謝克曼以及德國(guó)科學(xué)家托馬斯·祖德霍夫，以表彰他們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制。外泌體就是囊泡的其中一種。

一句話概括就是：外泌體就是一部貨拉拉，裝了自家一堆亂七八糟的東西（里面有miRNA，mRNA和lncRNA，還有細(xì)胞因子，或許還有點(diǎn)DNA），然后分泌出細(xì)胞外，再接著進(jìn)入另一個(gè)細(xì)胞，卸車完事。

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外泌體是何方神圣？

外泌體（exosome）是一類直徑30-150nm，具有完整膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸和信息傳遞。

1983年，外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)， 1987年，Johnstone將其命名為"exosome"。起源于細(xì)胞內(nèi)吞過程中形成的內(nèi)體，最后再?gòu)募?xì)胞中釋放到胞外。

作為細(xì)胞間的一種通訊方式，多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，例如細(xì)胞培養(yǎng)液、血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。其主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中 。

外泌體的電鏡照片

外泌體的電鏡是鑒定外泌體形態(tài)大小的一個(gè)常規(guī)手段，電鏡下呈典型的杯狀形態(tài)。細(xì)胞外囊泡 (extracellular vesicles, EVs)是機(jī)體遠(yuǎn)距離細(xì)胞間交流的一種手段。目前主要被分為3大類：外泌體、微囊泡和凋亡小體，臨床研究中主要關(guān)注的是外泌體。外泌體（直徑30~150nm，富含RNA和蛋白質(zhì)），再大的就屬于微囊泡（直徑100~350nm，富含金屬蛋白酶和磷脂酰絲氨酸），再大就是凋亡小體（500~1000nm，富含組蛋白）了，由細(xì)胞凋亡產(chǎn)生。

外泌體、微泡、凋亡小體三姐妹

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外泌體的生物學(xué)效應(yīng)和分離方法

外泌體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的方式有哪里呢？主要有以下兩種：

（1）直接作用。外泌體表面的蛋白分子或脂質(zhì)配體直接激活靶細(xì)胞表面的受體，產(chǎn)生信號(hào)復(fù)合體并激活胞內(nèi)信號(hào)通路；

（2）遞送作用。外泌體可以與靶細(xì)胞的質(zhì)膜融合或內(nèi)吞直接進(jìn)入細(xì)胞，將自身攜帶的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等活性分子帶到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的功能及生物學(xué)行為。

外泌體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的方式（以MSCs為例）

超速離心法是分離外泌體的標(biāo)準(zhǔn)方法。在4℃條件下依次以300G，2000G，10000G的轉(zhuǎn)速離心，依次去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片等，再以100000G超速離心得到外泌體。但離心法每次處理的樣本量較小，而且反復(fù)高速離心會(huì)導(dǎo)致外泌體破裂影響質(zhì)量?？筛鶕?jù)外泌體密度使用連續(xù)梯度蔗糖密度梯度離心法，蔗糖對(duì)細(xì)胞無毒，粘度不高且pH中性，所獲外泌體純度高，但含有難以去除的高密度化學(xué)物，不適合臨床應(yīng)用。超濾法用孔徑小于100nm的超濾膜短時(shí)間低速離心就可以分離得到外泌體，但超濾時(shí)施加的壓力比較大，導(dǎo)致體積大的囊泡變形和破裂。

超速離心法分離外泌體

我們也可通過CD63等外泌體特異性蛋白的抗體精準(zhǔn)分離。另外，基于聚乙二醇（PEG6000）等聚合物沉淀的方法也被用于分離外泌體。也有研究人員將微流控技術(shù)和聲學(xué)巧妙結(jié)合形成聲流體裝置，首先，利用較低頻率（19.6 MHz）聲波去除血液中尺寸較大的紅細(xì)胞、白細(xì)胞以及血小板等；然后采用較高頻率（39.4 MHz）的聲波將外泌體與細(xì)胞外囊泡亞組成分（凋亡小體、較大的細(xì)胞外囊泡等）進(jìn)行分離，并在通道的指定出口對(duì)外泌體進(jìn)行收集。

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外泌體用于組織修復(fù)再生

由外泌體介導(dǎo)的遞送具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1、具有高度生物相容性，如果它們來自適當(dāng)?shù)募?xì)胞（例如間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）或未成熟的DC），則同時(shí)具備免疫惰性；2、能夠穿越人體厚實(shí)的組織屏障，如血腦屏障（BBB）等。正常情況下，外泌體可以直接用作和免疫調(diào)節(jié)的潛在治療劑。

雖然說，干細(xì)胞外泌體成為研究熱點(diǎn)可能得益于干細(xì)胞研究的蓬勃發(fā)展，但干細(xì)胞外泌體確實(shí)有諸多優(yōu)勢(shì)。

*免疫原性低。外泌體比細(xì)胞具有更低的免疫原性。更容易地開發(fā)“貨架”產(chǎn)品。

*易保存。外泌體在-20°C下儲(chǔ)存6個(gè)月，-80°C長(zhǎng)期保存，同時(shí)不會(huì)損失其生化活性。

*穩(wěn)定。外泌體可保護(hù)其內(nèi)容物免于降解，從而防止某些活性成分快速降解。

*可量產(chǎn)。外泌體可在培養(yǎng)基內(nèi)大量富集。

*可控制。外泌體功能可通過改變細(xì)胞環(huán)境來改變。

MSCs外泌體具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗纖維化、抑制氧化應(yīng)激、增強(qiáng)血管生成等作用。這主要依賴于其中的蛋白和核酸組分。例如MSCs外泌體富含糖酵解相關(guān)酶，可增加ATP的產(chǎn)生，減少組織細(xì)胞死亡。MSCs外泌體還含有VEGF、TGF-β1、IL-6、IL-10和HGF等細(xì)胞因子，有利于血管生成和免疫調(diào)節(jié)。2018年4月，FDA批準(zhǔn)了Aegle公司的首個(gè)細(xì)胞外囊泡新藥（IND）申請(qǐng)，以開始用于燒傷患者的臨床試驗(yàn)。該公司通過分離純化MSCs分泌的細(xì)胞外囊泡，用以治療嚴(yán)重的皮膚病，包括燒傷和大皰性表皮松解癥。

外泌體可以促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合：促進(jìn)創(chuàng)面局部巨噬細(xì)胞從促炎M1向抑炎M2型轉(zhuǎn)變從而有助于組織修復(fù)，抑制肌成纖維細(xì)胞分化和過度纖維化，從而減少瘢痕形成。有研究表明，人脂肪干細(xì)胞（ADSCs）來源的外泌體，含有豐富的miRNA-125A和miRNA-31，可顯著促進(jìn)血管生成。而人羊膜上皮細(xì)胞來源外泌體，通過刺激基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1）的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。MSCs外泌體，也可用于調(diào)控系統(tǒng)紅斑狼瘡所致的骨質(zhì)疏松的BMSCs功能，增加骨密度促進(jìn)骨再生。

外泌體中的miRNA，可以調(diào)控基因表達(dá)，其比例比細(xì)胞更高，例如miR-155、let-7f、miR-199a、miR-221、miR-125b-5p和miR-22等等，參與多種生理和病理過程。例如外泌體釋放的miR-125b-5p就有助于改善心肌梗死區(qū)功能。

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外泌體用于腫瘤診斷和治療

腫瘤細(xì)胞的外泌體，含有大量與腫瘤相關(guān)的核酸和蛋白，在癌癥發(fā)生和早期檢測(cè)中具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。例如通過使用49種抗體來檢測(cè)來自431位肺癌患者和150位健康個(gè)體的外泌體蛋白發(fā)現(xiàn)，與健康個(gè)體相比，CD171和CD151在患者中高度表達(dá)，而外泌體CD151可作為檢測(cè)小細(xì)胞肺癌的標(biāo)志物。

外泌體內(nèi)容物作為腫瘤的潛在診斷標(biāo)志物（數(shù)據(jù)來源：中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志）

寄生蟲也可以，通過分泌外泌體將生物活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，調(diào)控宿主免疫，介導(dǎo)寄生蟲的免疫逃逸。例如瘧原蟲、錐蟲、血吸蟲和弓形蟲等均可以通過外泌體影響宿主免疫。

樹突細(xì)胞外泌體，可激活腫瘤特異性細(xì)胞毒性Ｔ淋巴細(xì)胞反應(yīng)并抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，有關(guān)樹突細(xì)胞外泌體應(yīng)用的多種臨床試驗(yàn)的開展，顯示出其作為治療方法應(yīng)用的巨大潛力，但樹突細(xì)胞外泌體表面PD-L1過表達(dá)限制其療效，而基于樹突細(xì)胞外泌體聯(lián)合療法如與PD-1/PD-L1中和抗體的聯(lián)合應(yīng)用，為樹突細(xì)胞外泌體抗腫瘤治療提供了新路徑。

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如何看待外泌體的成藥性

由于外泌體具有體積小、容易穿過細(xì)胞膜和免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥物的良好載體。外泌體結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，可以應(yīng)對(duì)不良理化環(huán)境。

基于外泌體開發(fā)和應(yīng)用的部分企業(yè)（圖：干細(xì)胞者說制）

目前，許多基于外泌體的I/II期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。不同來源的外泌體，在體內(nèi)顯示不同的歸巢能力，這可能是與其膜表面受體和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白有關(guān)。靜脈注射是基于外泌體遞送藥物中使用最為廣泛的給藥途徑。腹腔注射、瘤內(nèi)注射、口服和鼻腔給藥也在多種疾病模型中得到了嘗試。靜脈注射外泌體24h后，肝臟中熒光信號(hào)最強(qiáng)，其次是脾臟、胃腸道和肺部。

因此，外泌體注射后的分布，以及長(zhǎng)期的影響和安全性，仍將需要進(jìn)一步探索和闡明。

外泌體載藥可以分為三種：外源性載藥、內(nèi)源性載藥和轉(zhuǎn)基因。

外源性載藥方式：先分離外泌體，再將藥物通過轉(zhuǎn)染或電穿孔導(dǎo)入外泌體；

內(nèi)源性載藥方式：先將藥物導(dǎo)入細(xì)胞中，當(dāng)藥物進(jìn)入外泌體且從供體細(xì)胞中釋放后，分離純化得到載藥外泌體；

轉(zhuǎn)基因方式：通過轉(zhuǎn)基因的方式讓細(xì)胞自身表達(dá)，最終隨外泌體分泌至細(xì)胞外。

外泌體規(guī)模化應(yīng)用開發(fā)關(guān)鍵在于兩點(diǎn)：一是依賴于細(xì)胞培養(yǎng)條件的提升，3D培養(yǎng)是一個(gè)方向。二是依賴于外泌體分離純化方法的提升，濾膜分離是一個(gè)方向。哺乳動(dòng)物細(xì)胞釋放的外泌體較少，產(chǎn)量不高，可依次通過10μm、5μm和1μm的聚碳酸酯膜擠出外泌體-模擬納米囊泡，通過富集，產(chǎn)量比天然外泌體高出100倍以上，產(chǎn)量高且易于純化，為外泌體規(guī)?；瘧?yīng)用于臨床提供了可能。

近幾年，關(guān)于外泌體的研究文章數(shù)量呈井噴式發(fā)展，無論是提取制備工藝還是作為一種治療制劑和藥物，或者作為疾病的新型診斷標(biāo)志物，都有了長(zhǎng)足的發(fā)展。外泌體有希望成為人們通向健康大門的橋梁。

參考文獻(xiàn)（部分）

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