實體瘤CAR-T細胞治療分析
背景介紹：
細胞治療是近幾年興起的治療新技術(shù)，是指利用某些特定功能的細胞的特性，采用生物工程方法獲取或通過體外擴增、特殊培養(yǎng)等處理后，產(chǎn)生的特異性功能強大的細胞，回輸體內(nèi)后，從而達到治療疾病的目的。
過繼性細胞治療已經(jīng)研究經(jīng)過十多年了，并且一直是研究的熱點。其中包括LAK，DC，CIK，DC-CIK，CAR-T，TCR-T，NK，CAR-NK，腫瘤浸潤性淋巴細胞（TILs）等等。但是大浪淘沙，隨著研究的開展，能成功的治療方式并不多。其中CAR-T和TCR-T在研究中展現(xiàn)出出色的療效。而LAK，DC，CIK，DC-CIK基本被證明是無效的，或基本無效，雖然仍然有一些學者在艱苦研究DC相關(guān)的治療策略，但是目前未看到良好的成果。而NK/CAR-NK和Treg/CAR-Treg還處于早期研究，前路未明。
CAR-T技術(shù)原理
CAR-T技術(shù)（ChimericAntigen Receptor T-Cell，即T細胞嵌合抗原受體）通過基因工程手段修飾人的T細胞，使其表達嵌合抗原受體(chimeric antigen recetor, CAR)，即將識別腫瘤細胞表面抗原的抗體與激活T細胞所需的信號分子連接，以此增強T細胞對腫瘤的特異性殺傷。
TCR-T細胞、CAR-T細胞與體內(nèi)正常T細胞一樣都是通過T細胞對特異性癌癥細胞抗原的識別能力和進攻能力。TCR-T與CAR-T通過基因改造的手段提高T細胞受體對特異性癌癥細胞抗原的識別。因此也都統(tǒng)稱為“T細胞受體重新定向”技術(shù)（T cell receptor redirection）。但是CAR-T與TCR-T的抗原識別機制是完全不同的。TCR-T細胞與體內(nèi)的正常T細胞識別的抗原是需要通過MHC分子呈遞。而CART則利用能夠與特定抗原結(jié)合的抗體片段來識別腫瘤細胞表面的抗原。識別方式上的差異導致TCR-T和CAR-T在應(yīng)用領(lǐng)域有著相應(yīng)不同的優(yōu)勢和劣勢。
政策
至2016年以來，CAR-T行業(yè)的監(jiān)管政策層出不窮。政策主要是來自國家藥監(jiān)局和衛(wèi)健委兩個層面的。
2019年3月的《體細胞治療臨床研究和轉(zhuǎn)化應(yīng)用管理辦法》核心內(nèi)容是明確了醫(yī)療機構(gòu)作為責任主體，進行體細胞治療等新技術(shù)的臨床研究，獲得安全有效性數(shù)據(jù)后，可以申請臨床應(yīng)用并收費。但是個人覺得不必擔心行業(yè)再進入出現(xiàn)“魏則西“事件的那個年代。中國醫(yī)療行業(yè)經(jīng)歷了這么多年的發(fā)展，監(jiān)管部門也已經(jīng)意識到了監(jiān)管的重要性。細胞質(zhì)量產(chǎn)品的開發(fā)是一個復雜的過程，需要建立一整套體系才能達到穩(wěn)定的質(zhì)量控制，醫(yī)院是否能投入這一體系建設(shè)還要面臨很多現(xiàn)實的考慮。
小結(jié)：
FDA的監(jiān)管宗旨是以風險為導向的監(jiān)管體系，現(xiàn)在已經(jīng)明確以藥物監(jiān)管的方式來監(jiān)管CAR-T，中國實行雙軌制也是為了“提速”臨床，但根據(jù)美國發(fā)展來看未來依然是以藥物監(jiān)管為主導。
CAR-T的發(fā)展現(xiàn)狀
1.國際進展：
2017年，美國批準了兩款自體CAR-T產(chǎn)品，針對血液瘤，療效顯著，但復發(fā)率高，價格昂貴，當前滲透率還較低。全球在研依然火熱，國內(nèi)臨床在研數(shù)量和美國持平。
2.國內(nèi)進展：
國內(nèi)無產(chǎn)品上市，大概20幾家企業(yè)申報臨床，約30個產(chǎn)品，其中11個產(chǎn)品獲批臨床，國內(nèi)CAR-T研發(fā)特點：
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競爭激烈，同質(zhì)化嚴重；
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創(chuàng)新少，基本是模仿國外產(chǎn)品，缺少獨立IP；
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國內(nèi)企業(yè)在后期的生產(chǎn)工藝上較國外還是有差距，很多企業(yè)在正規(guī)的生產(chǎn)環(huán)節(jié)會遇到瓶頸。
3.CAR-T行業(yè)痛點：
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自體治療，費用高，市場受限；
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血液瘤，市場天花板低，實體瘤問題沒解決；
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安全性問題大，復發(fā)率高。
4.未來發(fā)展趨勢：
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降低制備成本，比如從自體走向通用型；
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實體瘤攻克；
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提高安全性，降低復發(fā)率。
表1 CAR-T各個靶點國內(nèi)競爭情況
CAR-T的局限：從血液瘤到實體瘤
CAR-T在血液瘤上的成效是有目共睹的，在全球性ELIANA試驗中，Kymriah治療后3個月的完全緩解率為83%，6個月的生存率為89%。ZUMA-1試驗的初步分析顯示，惡性淋巴瘤患者接受YESCARTA單次輸注治療后，總緩解率為82%，完全緩解率為54%。中位隨訪8.7個月，44%的患者仍保持緩解，6個月的完全緩解率為47%。雖然CAR-T在血液瘤上大放異彩，但是在實體瘤的應(yīng)用上頻頻受限。對比血液瘤，在實體瘤上CAR-T應(yīng)用有如下難點。
1、實體瘤靶點選擇問題
第一，實體瘤靶點選擇問題。血液瘤靶點CD19會在所有的B細胞上表達卻不在其他組織和血液細胞中表達，血液中也未曾檢測到CD19可溶性蛋白的存在，CD19是B淋巴細胞白血病的一個非常理想的靶點。但是實體瘤的異質(zhì)性是實體腫瘤更為突出的特點之一，這也意味著即使是同一位患者一個部位的腫瘤也并非均表達相同的腫瘤相關(guān)性抗原。即使在一個腫瘤病灶上，無一種靶抗原可以覆蓋全部的腫瘤細胞。
2、實體瘤浸潤問題
第二，CAR-T對于實體瘤的浸潤問題。血液環(huán)境是一種勻質(zhì)的環(huán)境，不存在CAR-T的浸潤問題。而實體瘤則具有纖維組織的腫瘤屏障，且屏障內(nèi)部腫瘤微環(huán)境是一種低PH、低氧、低營養(yǎng)、高滲透壓的環(huán)境，不利于CAR-T細胞的浸潤激活增殖。
另外腫瘤高內(nèi)皮小靜脈（HEV），人體正常T細胞浸潤發(fā)炎或者病變組織的方式是通過扁平的毛細血管進行HEV變化。T細胞通過HEV的表皮細胞定位并浸潤組織。在腫瘤晚期，腫瘤細胞釋放多種細胞因子損害HEV表皮細胞，因此腫瘤組織的形成的血管缺少表皮細胞，無法成為成熟的HEV血管。不成熟的HEV血管導致了T細胞的浸潤能力下降。
3、腫瘤微環(huán)境
第三，免疫抑制的腫瘤微環(huán)境。實體瘤微環(huán)境中，不僅有TGF-β等免疫抑制因子，腫瘤細胞表面也會表達多種免疫抑制信號。另外，腫瘤微環(huán)境中還有Treg等免疫抑制調(diào)控細胞，CAR-T在進入腫瘤微環(huán)境之后，收到多種免疫抑制信號的調(diào)控，抑制其活性。
實體瘤CAR-T進展
1、靶點選擇
不像血液瘤中CD19表達于所有B細胞表面，實體瘤的抗體選擇更為復雜。常見的實體瘤靶點有HER2，CEA，EGFR，GD2，PSMA，Mesothelin,MUC1等都是腫瘤相關(guān)性靶點，在腫瘤中高表達，在正常組織中也有少量的表達。比如HER2靶點廣泛出現(xiàn)在乳腺癌中，但是在正常的心肺組織中，也有少量表達。曾有有患者接受了靶向HER2的CAR-T治療，在5天之后，因為CAR-T誘導的心肺功能衰竭而死亡。實體瘤靶點有EGFR/EGFRvIII，HER2，CEA，MSLN，F(xiàn)AP，cMet，GPC3，GD2，MUC1，L1-CAM等。
表2 CAR-T實體瘤靶點
資料來源：Nature,公開資料
表3 各個實體瘤靶點在腫瘤組織和正常組織中的表達情況
小結(jié)：
從上表來看，除了GPC3之外，其他蛋白抗原都存在與人體正常組織中，因此控制CAR-T的on-target毒性成為非常關(guān)鍵的因素。根據(jù)臨床推進來看，可以關(guān)注MSLN，GPC3以及新型腫瘤特異性靶點在臨床上的進展。
2、CAR-T的浸潤及微環(huán)境克服策略：
在找到靶點后，CAR-T如何找到實體瘤并且浸潤發(fā)揮作用又是另一難題。一是腫瘤血管不成熟，扭曲導致在實體瘤內(nèi)部幾乎沒有T細胞被發(fā)現(xiàn)。因此一些血管形成的靶點如VEGF聯(lián)合CAR-T的治療會幫助CAR-T的浸潤。
另外，CAR-T的定位需要一些炎癥因子如CCL2，而腫瘤細胞很少釋放這類因子，曾有臨床前試驗在動物模型中用攜帶CCL2基因的牛痘病毒去感染腫瘤細胞，在感染后腫瘤周圍發(fā)現(xiàn)了許多CAR-T細胞被招募。
最后腫瘤表面有一層纖維組織，這層組織成為了腫瘤的物理屏障。有一個方法是使CAR-T細胞同時表達乙酰肝素酶，通過乙酰肝素酶降解腫瘤的纖維化細胞外基質(zhì)，克服物理屏障。
實體瘤內(nèi)部會產(chǎn)生多種免疫抑制的信號，如PD-L1高表達，TGF-β等免疫抑制因子，這些免疫抑制環(huán)境會抑制Car-T發(fā)揮其效用。在技術(shù)發(fā)展過程中，攜帶炎癥因子或者PD-1敲減的CAR-T產(chǎn)品逐漸出現(xiàn)。在2018年，上海普珩生物技術(shù)有限公司宣布，用于治療轉(zhuǎn)移性腎細胞癌的兩個新型腫瘤酸性微環(huán)境激活CAR-T產(chǎn)品臨床試驗信息正式公布在clinicaltrials.gov上。這款CAR-T利用腫瘤內(nèi)部原本具有抑制作用的酸性環(huán)境激活，既解決了腫瘤內(nèi)部的酸性環(huán)境抑制，又解決了CAR-T的脫靶毒性問題。
但是這些方法在臨床上的驗證相對較少，臨床階段處于早期而且樣本量較小。另外并沒有某種方式呈現(xiàn)出巨大的療效，實體瘤CAR-T的發(fā)展還有很長一段路要走。
表4 采用不同策略下的實體瘤CAR-T臨床試驗
行業(yè)地圖
目前，幾家大型的CAR-T療法公司對實體瘤的布局有限，諾華和Bluebird的CAR-T細胞治療產(chǎn)品在實體瘤也只有較少布局，吉利德科學雖然也沒有，但有一個探索性的TCR研究，國外多以研究所機構(gòu)布局為主。
表5 國際上獲得實體瘤CAR-T臨床批件的機構(gòu)
表6 國內(nèi)獲得實體瘤CAR-T臨床批件的企業(yè)
小結(jié)：
可以看到實體瘤CAR-T的進展還處于比較早期階段，絕大多數(shù)臨床還處于早期的臨床階段，樣本量較少。通過基因編輯“武裝”CAR-T和條件激活CAR-T成為主流嘗試方向。從上述臨床數(shù)據(jù)來看，Atara針對MSLN靶點治療多線耐藥后的乳腺癌，入組27人緩解率達到50%以上，治療效果和樣本量都不錯。
國外可以關(guān)注諾華，Juno等大藥企的動向，國內(nèi)可以關(guān)注科濟生物的進展?？茲锸菄鴥?nèi)CAR-T實體瘤治療的領(lǐng)軍企業(yè)，其創(chuàng)新靶點CLDN18.2治療胃癌也達到了33.3%的ORR，值得關(guān)注。
CAR-T產(chǎn)業(yè)化難點：從自體CAR-T到異體CAR-T（UCAR-T）
CAR-T的產(chǎn)業(yè)化存在兩個關(guān)鍵性的環(huán)節(jié)，一是用于制備CAR-T的CAR的慢病毒載體；二是CAR-T產(chǎn)品的制備，儲存，質(zhì)量控制工藝。Kite花了將近1年的時間將CAR-T產(chǎn)品的制備出廠時間從10-12天降低為6-9天。由此可見CAR-T的制備工藝具有較高的壁壘。目前自體回輸型CAR-T的GMP工藝流程如圖四所示?？梢钥吹紺AR-T的制備工藝階段繁多，并且由于細胞產(chǎn)品極易被污染，環(huán)節(jié)與環(huán)節(jié)之間的過渡需要在封閉的環(huán)境下進行。諾華采用的措施是通過自動化或者半自動化的系統(tǒng)減少污染的幾率。
自體回輸?shù)腃AR-T制備工藝經(jīng)過：T細胞采集及儲存-T細胞的富集-T細胞激活-T細胞轉(zhuǎn)導修飾-T細胞擴增-成品CAR-T儲存等。質(zhì)量控制和檢測環(huán)節(jié)貫穿整條工藝線。在整個工藝流程中，有幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)和關(guān)鍵指標需要注意。以下分析的基礎(chǔ)為已上市的兩款CAR-T產(chǎn)品和中國食品藥品檢定研究院發(fā)布的CAR-T的生產(chǎn)考慮要點。
圖7 CAR-T的GMP工藝流程
T細胞采集純化：
也即 T 細胞的獲取 一般為從血液中分離純化 而純化的方法也可以分成培養(yǎng)過程中調(diào)整培養(yǎng)基進行選擇和直接磁珠法分選等手段與企業(yè)整個 T 細胞 處理的思路有關(guān) 需要全面考察其 技術(shù)路線和分離的純度、收獲率、活細胞率等。
轉(zhuǎn)染 ：
轉(zhuǎn)染環(huán)節(jié) 最直觀的指標為轉(zhuǎn)染效率 （陽性率諾華為 50%，國內(nèi)企業(yè)從 20%-80%不等，但過高可能意味著 CAR 基因啟動子強度過高或者病毒使用過多，存在致癌風險，因此追高無意義，只要滿足使用所需的細胞絕對量即可。
T細胞擴增：
細胞培養(yǎng)是比較成熟的環(huán)節(jié)，但也是比較考驗企業(yè)工藝的環(huán)節(jié)，培養(yǎng)基、生長因子、細胞因子等的選擇和操作規(guī)程都比較重要。細胞因子等的選擇和操作規(guī)程都比較重要。此環(huán)節(jié)主要指標為擴增時間和倍數(shù)指標為擴增時間和倍數(shù)，國內(nèi)和國外都將擴增時間控制在1-2周，擴增倍數(shù)在100倍左右。
回輸：
血液瘤CAR-T 一般按每公斤體重約106的細胞量進行回輸 但也要參考患者的具體情況 。對實體瘤而言 直接在腫瘤部位給藥并不能提高治療效果，但有報道稱在腫瘤部位植入含 CAR-T 細胞的微型裝置并緩釋細胞因子進行持續(xù)刺激可以提高對實體瘤的效果，需要驗證。
總結(jié)來看，目前CAR-T工業(yè)化存在的難點有如下幾點：
1、自體回輸型CAR-T需要根據(jù)個體差異提取細胞，提取的原材料的細胞數(shù)量，活性，細胞亞群比例均不同，需要標準化的通用型CAR-T細胞產(chǎn)品，但是現(xiàn)在UCAR-T的安全性依然存疑。
2、傳統(tǒng)CAR-T生產(chǎn)需要病毒載體，病毒載體的質(zhì)量將直接影響后續(xù)CAR-T生產(chǎn)中的轉(zhuǎn)染效率和安全性問題。其他轉(zhuǎn)染方式制備CAR-T的技術(shù)還不成熟。
3、CAR-T的制備工藝步驟繁多，質(zhì)量控制耗費巨大。整條產(chǎn)線各個環(huán)節(jié)要求盡量減少在外界的暴露，國外CAR-T的產(chǎn)線構(gòu)建是以半自動化或全自動化為標準，目前國內(nèi)已有的CAR-T產(chǎn)線還未達到半自動化標準。
4、CAR-T的產(chǎn)業(yè)標準還不成熟。
投資邏輯：小結(jié)
實體瘤CAR-T企業(yè)投資邏輯除了關(guān)注產(chǎn)業(yè)化制備工藝，成本問題，產(chǎn)品安全性，研發(fā)進度及團隊之外，更要關(guān)注如何解決實體瘤CAR-T的三大難點，并且要關(guān)注臨床前和臨床試驗數(shù)據(jù)的支持。
1、產(chǎn)品靶點選擇
2、腫瘤微環(huán)境的克服
3、浸潤問題，并且關(guān)注相關(guān)臨床前和臨床試驗數(shù)據(jù)支持。
目前已有的策略：
一是讓CAR-T攜帶并表達各種各樣的免疫因子，分泌PD-1抗體或者是PD-1敲除的CAR-T等。
二是使CAR-T進行條件激活，在TME環(huán)境下特異性激活CAR-T。
三是多方案聯(lián)合治療。
CAR-T實體瘤上的進展還相對處于早期，這些想法還沒有在臨床上得到大數(shù)據(jù)樣本的驗證。
