CAR-T 免疫療法 (Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy)

2010年五月，家住美國賓州Hershey市的剛滿五歲的女孩Emily Whitehead被確診患急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia, ALL）。當(dāng)時她像很多同病患兒一樣，在住處附近的Hershey Medical Center開始化療?；熞荒臧牒髲?fù)發(fā)。在以后的3個多月，Emily繼續(xù)接受強化性化療，為2012年二月份的骨髓移植做準(zhǔn)備。ALL是一種常見的兒童癌癥。雖然百分之八十五的ALL兒童在經(jīng)過兩年的標(biāo)準(zhǔn)化療后有很好療效，但是對于化療耐藥的兒童就沒有其它有效治療方法。Emily的復(fù)發(fā)證明她患的是那種抗藥的ALL。
骨髓移植前兩周，Emily再次復(fù)發(fā)。盡管醫(yī)生用盡了各種化療，都不能阻止病情惡化。2012年4月，Emily從當(dāng)?shù)蒯t(yī)院轉(zhuǎn)到了費城兒童醫(yī)院(CHOP)。那里的醫(yī)生告訴家長，因為兩次化療失敗，可試用一種正在進行I期臨床試驗的新療法。同時醫(yī)生也告訴家長該療法的高風(fēng)險。Emily 的的父母，Tom 和Kari，考慮女兒病情繼續(xù)惡化，表達(dá)了他們同意試一試新療法的想法。這樣，在費城兒童醫(yī)院癌癥中心，Emily正好符合實驗性CAR-T細(xì)胞治療，新的臨床試驗開始。
圖1，CAR-T治療前后的Emily

2012年4月17日，Emily成為第一個接受CAR-T細(xì)胞治療的兒科患者。接受治療三周后，她奇跡般恢復(fù)。CAR-T細(xì)胞治療對Emily 完全有效。三個月和六個月后再次檢查她的骨髓，骨髓里已查不到任何癌癥細(xì)胞， 而且抗癌癥CAR-T細(xì)胞仍然存活在她的體內(nèi)。
對于Kari和Tom，不可思議的是，Emily在短短幾個月內(nèi)變化很大。經(jīng)過治療，她已能回到家，上學(xué)，踢足球和溜狗。她像任何其他小女孩一樣, 可以正常生活。
圖2，治療后的Emily， 1 年，2 年，3 年，4 年，以及和前總統(tǒng)的照片。

CAR-T 細(xì)胞治療為什么能創(chuàng)造奇跡，是由于科學(xué)家將T 淋巴細(xì)胞改裝成能夠識別和殺傷腫
瘤的T 淋巴細(xì)胞。 腫瘤免疫主要由細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（CTL）介導(dǎo)?；罨腡 淋巴細(xì)胞才能殺傷腫
瘤。當(dāng)腫瘤細(xì)胞抗原遞呈特異性信號，會被T 細(xì)胞表面受體(TCR)識別。TCR 可變區(qū)和抗原的相
互作用會引發(fā)與TCR 相連的CD3 的ζ亞基激活產(chǎn)生第一信號, T 淋巴細(xì)胞會有應(yīng)答反應(yīng)。僅有第
一信號引起T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)是不足以殺傷腫瘤的，需要有協(xié)同刺激信號如CD28 參與和激活所產(chǎn)
生的第二信號才能夠引起有效的T 細(xì)胞反應(yīng)。 兩個信號都被激活是活化T 淋巴細(xì)胞，并且產(chǎn)生反
應(yīng)的重要條件。
綜上所述，T 細(xì)胞殺傷腫瘤是經(jīng)過其TCR 識別腫瘤抗原，引發(fā)與TCR 相連的CD3 的ζ亞
基激活，同時在激活的協(xié)同刺激第二信號CD28 參與下，殺傷或/和消滅腫瘤細(xì)胞。腫瘤的形成是
由于種種原因，T 細(xì)胞不能識別腫瘤抗原，清除細(xì)胞，導(dǎo)至細(xì)胞無控制生長。除了CD28 外，還
有其它分子，如4-1BB, OX40 也充當(dāng)正向協(xié)同刺激信號。
人為的針對腫瘤的靶點制備特異性抗體，然后利用基因工程技術(shù)將抗體具有結(jié)合功能的區(qū)
域替代T 細(xì)胞受體(TCR)的可變區(qū)，形式TCR 和抗體嵌合體（Chimeric Antigen Receptor,
CAR），利用病毒載體，加入到人體外的T 細(xì)胞，抗體能表達(dá)在T 細(xì)胞表面，這種含有嵌合抗體
的T 細(xì)胞叫CAR-T 細(xì)胞(CAR 加上 T 細(xì)胞)。當(dāng)CAR-T 細(xì)胞輸回到病人體內(nèi)，抗體就能識別并特
異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞上的靶點，激活T 細(xì)胞并使之殺死腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療的目的。（圖3）
圖3， T 細(xì)胞兩個激活信號，CAR將兩個激活信號結(jié)合在一起。

典型CAR的結(jié)構(gòu)由胞外抗原結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)域和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)組成。其中胞外抗原結(jié)合區(qū)來源于單克隆抗體的單鏈抗體 (single chain fragment variable. scFv)，單鏈抗體是由輕鏈 (VH) 和重鏈 (VL)通過連接而形成的。scFv是CAR結(jié)構(gòu)里的第一個關(guān)鍵部位，它能識別腫瘤特異性抗原，即所說的靶點，比如CD19, EGFR等，而不是需要加工遞呈出來的抗原多肽。因此這樣的結(jié)構(gòu)解決了兩大問題：靶向性問題和繞開抗原遞呈的問題。（圖4，5）
圖4，CAR-T細(xì)胞。

圖5，TCR的部份被scFv替換，T細(xì)胞改造成CAR-T細(xì)胞。

細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)主要為CD3ζ或FcεRIγ含有免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAM,)以及第二刺激信號CD28或者其它分子，4-1BB, OX40等正向協(xié)同刺激信號。根據(jù)CAR結(jié)構(gòu)的進化，有第一代，第二代和第三代。幾代CAR-T的區(qū)別在于細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)到區(qū)連入了不同的正向協(xié)同刺激信號：第一代CAR(左)由單鏈抗體通過跨膜區(qū)域與胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)(ITAM)相連, ITAM通常為CD3ζ或FcεRIγ; 第二代CAR(中)的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)引入了共刺激分子, 主要為CD28 或4-BB; 第三代CAR(右)同時引入了兩個共刺激分子, 主要為CD28加上4-BB 或OX40。早期的實驗證明了CAR-T 的可行性，然而第一代CAR 只能引起短暫的T 細(xì)胞增殖和較低的細(xì)胞因子分泌，不能提供長時間的T 細(xì)胞擴增信號和持續(xù)的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。依照T 細(xì)胞活化的雙信號學(xué)說，T 細(xì)胞的激活和增殖需要兩個共刺激信號；第二代、第三代CAR 引入了共刺激分子信號序列，旨在提高T 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性、增殖性與存活時間，并且促進細(xì)胞因子的釋放。
圖6，

CAR-T治療，簡單來說有五步：
1： 從癌癥病人身上分離免疫T細(xì)胞。
2: 利用基因工程技術(shù)給體外的T細(xì)胞加入一個能識別腫瘤細(xì)胞，
并且同時激活T細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞的嵌合抗體，從而使T細(xì)胞
變身為CAR-T細(xì)胞。
3： 體外培養(yǎng)，大量擴增CAR-T細(xì)胞。
4： 把擴增好的CAR-T細(xì)胞輸回病人體內(nèi)。
5： 嚴(yán)密監(jiān)護病人，控制身體的劇烈副反應(yīng)（見后述）。
圖7，CAR-T治療的流程：

針對CD19、CD20和CD22為靶抗原的CAR-T細(xì)胞治療B細(xì)胞惡性腫瘤研究較多, 原因就是即便損傷了成熟B細(xì)胞, 也只是暫時的、可恢復(fù)的。美國賓州Hershey女孩 ，Emily Whitehead 患有急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，治療靶點為CD19。
圖8，

從圖8中看出，CD19在pre-B 和 成熟B細(xì)胞，包括正常和惡性增殖的B細(xì)胞表達(dá), 但是淋巴干細(xì)胞和成熟漿細(xì)胞沒有CD19。帶有抗CD19 scFv 的CAR-T 細(xì)胞可以攻擊pre-B 和成熟B細(xì)胞而不傷害淋巴干細(xì)胞，保留了淋巴干細(xì)胞的再生功能。使用抗CD19的CAR-T細(xì)胞進行
治療，其毒性僅限於B細(xì)胞系，B 細(xì)胞功能缺陷可通過輸入丙種球蛋白來彌補。CAR-T 細(xì)胞可以在病人體內(nèi)持續(xù)很長一段時間，5年后今天的Emily Whitehead 體內(nèi)仍有CAR-T細(xì)胞。
CD19靶點的CAR-T臨床治療進展最為突出，在治療白血病ALL、CLL (Chronic Lymphocytic Leukemia),和NHL(B 細(xì)胞non-Hodgkin lymphomas)的領(lǐng)域捷報頻傳。從2012年到2016年，美國賓州大學(xué)教授Carl H. June 用CD19 CAR-T治療了60個ALL病人，其療效高達(dá)93%。這些ALL患者往往是復(fù)發(fā)或抗藥的，其它治療方法都已耗盡。截止到2016年5月，Carl H. June 用CD19 CAR-T已經(jīng)治療了368 個B淋巴細(xì)胞腫瘤病人。
其它研究較多的靶點有Her2、GD2、CEA、mesothelin、BCMA等。需要做更多研究的是；尋找腫瘤特異性更強的抗原，或相同抗原高表達(dá)在腫瘤細(xì)胞, 低表達(dá)在正常細(xì)胞。改進CAR-T細(xì)胞上scFv抗體的親和力。設(shè)計雙功能的CAR-T和自殺開關(guān)如引入iCasp9基因等。
CAR-T治療也面臨著臨床風(fēng)險；
1，細(xì)胞因子風(fēng)暴，也叫細(xì)胞因子釋放綜合征。產(chǎn)生的原因是T細(xì)胞在殺死其它細(xì)胞的時候會釋放很多細(xì)胞因子如IL-6、INF-? 等，它們的作用是激活更多的免疫細(xì)胞來一起對抗這些病原體，這種正反饋機制保證了對病原體的快速清除。同時在臨床上也引起了劇烈的炎癥反應(yīng)。由于CAR-T殺癌細(xì)胞實在是太快太有效了，于是瞬間在局部產(chǎn)生超大量的細(xì)胞因子，引起驚人的免疫反應(yīng)，稱為細(xì)胞因子風(fēng)暴。其臨床表現(xiàn)；病人超高燒不退，嚴(yán)重時可危及生命。前述CAR-T治療的最后一步是嚴(yán)密監(jiān)護病人。女孩Emily Whitehead接受CAR-T治療的最后，曾經(jīng)高燒到昏迷不醒，病情危險。幸好后來使用抗IL-6R抗體Tocilizumab, 使她馬上轉(zhuǎn)危為安。當(dāng)然現(xiàn)在臨床上經(jīng)驗已經(jīng)豐富了很多，對細(xì)胞因子風(fēng)暴有了認(rèn)識并提前準(zhǔn)備，控制風(fēng)險也更有把握了。
2，CAR-T治療另一毒性是神經(jīng)毒性。接受治療的病人會出現(xiàn)腦水腫，并可能因此致死。
CAR-T療法在白血病治療的成功激發(fā)了投資者的興趣，大量資金涌入CAR-T 領(lǐng)域，推動了生物產(chǎn)業(yè)與研究機構(gòu)的臨床研究合作。2014年6月，只有19名員工的KITE生物技術(shù)公司在納斯達(dá)克上市，一天內(nèi)攬金1億3千萬美！同樣不到20人的JUNO生物技術(shù)公司2014一年之內(nèi)成功融資超過3億，并于當(dāng)年12月在納斯達(dá)克上市時再次募集了2.65億美元。這兩個小公司沒有任何收入，沒有一個上市的藥物，是因為投資人青睞CAR-T的技術(shù)，一個也許能治愈癌癥的技術(shù)。
賓夕法尼亞大學(xué)攜手諾華(Novartis)；KITE則與NCI合作。2013年，F(xiàn)red Hutchinson癌癥中心、Memorial Sloan Kettering 癌癥中心和西雅圖兒童醫(yī)院的科學(xué)家聯(lián)手成立了JUNO。形成了三巨頭鼎立的局面。另外，禮來、葛蘭素史克、強生、默克也投資介入CAR-T領(lǐng)域。其他的CAR-T研發(fā)型企業(yè)包括BlueBird、Bellicum、Cellectis等多家也涉足CAR-T療法。2015年CAR-T研發(fā)型企業(yè)17家，2016年超過100多家。
2012年，Novartis與賓夕法尼亞大學(xué)合作開發(fā)基于CD19 靶點的CAR-T技術(shù)，斥資2000萬美元新建實驗室，2014年又斥資2000萬美元在賓大醫(yī)學(xué)院建立一個細(xì)胞療法研究中心，成為全球首個綜合性CAR-T細(xì)胞療法開發(fā)中心。2014 年7 月，其CTL019 獲得了FDA的突破性療法認(rèn)定，藥物研發(fā)完畢后享受一切FDA 審批的綠色通道。美國賓州大學(xué)教授Carl H. June 的臨床試驗和Emily 的治療都是源于Novartis的合作。
Juno Therapeutics (JUNO)則與上述的三家醫(yī)學(xué)機構(gòu)合作。在2016 6月ASCO上報道的臨床研究中，51名復(fù)發(fā)或難治性（r / r）急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）成年患者用環(huán)磷酰胺或氟達(dá)拉濱/ 環(huán)磷酰胺，然后輸注JCAR015。隨訪研究觀察到90％的完全緩解率（CR）。然而在同年7月6日，JCAR015在Ⅱ期臨床試驗中導(dǎo)致2例患者腦水腫死亡而被叫停。JUNO認(rèn)為是由于CAR-T治療前用藥氟達(dá)拉濱引起。但是去除氟達(dá)拉濱后繼續(xù)臨床試驗，11月23日又出現(xiàn)了三個腦水腫死亡病例，JUNO不得不終止JCAR015臨床試驗，痛失了在CAR-T的領(lǐng)先地位。JUNO將其重心轉(zhuǎn)向其它產(chǎn)品，JCAR17 和 JCAR14等。它們的區(qū)別見圖9。
圖9， JUNO JACR-14, JCAR-15 和 JCAR17。

KITE 與美國國家癌癥研究所（NCI）建立了廣泛的合作關(guān)系， 2016年 12月ASH上，KITE公布了其CAR-T療法KTE-C19-101（ZUMA-1）針對難治性惡性NHL的臨床數(shù)據(jù)。51例DLBCL患者中完全緩解率為47%。KITE 的研發(fā)進度原本稍落后于JUNO和Novartis。但是在2016年12月4日，KITE 宣布其領(lǐng)先產(chǎn)品KTE-C19已經(jīng)啟動BLA滾動申報，適應(yīng)癥為B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，從而后來居上。KTE-C19的共刺激分子與JUNO的JCAR15一樣為CD28，而不是4-BB。見圖10。
圖10，

研究人員幾十年來一直在努力探索，利用身體免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤。這些努力正在取得成效。癌癥免疫療法目前在CAR-T和免疫檢查點抑制劑（另文詳述）兩種不同的技術(shù)上，臨床治療獲得顯著成效?？茖W(xué)雜志的編輯們選擇了癌癥免疫治療作為2013年度的重大突破。
從目前CAR-T的臨床前實驗研究結(jié)果和臨床應(yīng)用方面來看，治療血液癌癥，特別是CD19抗原的腫瘤效果很好，但在實體瘤的效果不佳，同時也遇到安全性和治療后復(fù)發(fā)等問題。產(chǎn)業(yè)化制備也有待于降底治療的成本。既使這樣，CAR-T和免疫檢查點抑制劑治療癌癥的免疫療法已初露曙光。
張克明；2017年3月31日